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Annexin V-FITC/PI Kit 凋亡检测试剂盒
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  • 货号 FXP018-050
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  • 储存条件 2-8℃避光保存,勿冰冻
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相关介绍
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细
胞膜外,使PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋
亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS 暴露在细胞膜外。Annexin V 具有易于结合到磷脂类如
PS 的特性,对PS 有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS 转移到
细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是
完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以采用Annexin V 与PI 双染的方法,通
过流式检测细胞早期凋亡。

【储存条件】
2-8℃避光保存,勿冰冻。

【注意事项】
本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。
此产品仅供研究,不用于临床诊断。

【试剂盒组份】
1. 结合缓冲液4x (Binding Buffer 4x)
体积:50 Tests: 10ml(4倍浓缩液)
稀释后溶液中各组分浓度:10mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl2

2. 碘化丙锭溶液(Propidium Iodide, PI)
体积: 50 Tests: 0.5ml
浓度: 20ug/ml

3. 重组人Annexin V/FITC, (rh Annexin V/FITC)
来源:大肠杆菌(E.coli)
分子量:35.8 KDa
样品量:50 Tests: 0.25ml,可用于50次实验
保存方法:于50mM Tris, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4 溶液中保存
纯度:SDS-PAGE及反相HPLC表明纯度大于98%
生物活性:Annexin V可结合于磷酯酰丝氨酸并表现出抗磷酯酶活性

【操作步骤】
1. 细胞样品的准备:
a)对于贴壁细胞:小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞,至细胞可以被轻轻用移液管
或枪头吹打下来时,加入前面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。
1000rpm左右离心5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞无法完全离心至离心管底,可以适当延长离心时间或
稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约50μl左右的培养液,以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS,重悬
细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。
b)对于悬浮细胞:1000rpm左右离心5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞无法完全离心至离心管底,可以适
当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约50μl左右的培养液,以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃
预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。

2. 用去离子水按1:3稀释结合缓冲液(4ml 4x结合缓冲液+12ml去离子水);

3. 用1x结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其浓度为1-5×106/ml;

4. 取100μl的细胞悬液于5ml流式管中,加入5μl Annexin V/FITC混匀后于室温避光孵育5分钟;

5. 加入10μl 20ug/ml的碘化丙锭溶液(PI),并加400μl PBS,立刻进行流式检测。

【实验设计】
空白管:阴性对照组细胞,不加Annexin V/FITC,碘化丙锭溶液(PI)。用于调节电压
单染管:阳性对照组细胞,只加Annexin V/FITC。用于调节补偿
检测管:处理的细胞,加Annexin V/FITC,碘化丙锭溶液(PI)。用空白管和单染管调节好电压补偿后,获得所需要的
流式数据。


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